論文

公開件数: 62 件
No. 掲載種別 単著・共著区分 タイトル 著者 誌名 出版者 巻号頁 出版日 ISSN DOI URL 概要
1 研究論文(学術雑誌)
共著
Complete pyridine nucleotide-specificity conversion of an NADH-dependent ferredoxin reductase.
Akito Nishizawa, Ayaka Harada, Miki Senda, Yuka Tachihara, Daisuke Muramatsu, Shinya Kishigami, Shigemasa Mori, Keisuke Sugiyama, Toshiya Senda, shigenobu Kimura
Biochem. J.

462/ 2, 257-265
2014/09/01

10.1042/BJ20140384

The coenzyme specificity of enzymes is one of the critical parameters for the engineered production of biological compounds using bacteria. Since NADPH is produced abundantly in photosynthetic organisms, conversion of an NADH-specific enzyme to an NADPH-specific one is a useful approach to the efficient carbon neutral production of biological compounds in photosynthetic organisms. In this study, an NADH-specific ferredoxin reductase component, BphA4 of biphenyl dioxygenase BphA from Acidovorax sp. strain KKS102, was changed to an NADPH-dependent form using a method combining structure-based systematic mutations and site-directed random mutagenesis. The resultant CRG mutant, in which Glu175-Thr176-Gln177 of an NADH recognition loop in the wild-type BphA4 was replaced with Cys175-Arg176-Gly177, was highly specific and active for NADPH, and its biochemical and structural properties for NADPH were nearly the same as those of the wild-type BphA4 for NADH. In addition, this mutation project was assessed by a semi-empirical prediction method of mutation effects, and the results suggested that the CRG mutant was one of the best NADPH-specific mutants.
2 研究論文(学術雑誌)
共著
Ribosome-binding site interference caused by Shine-Dalgarno-like nucleotide sequences in Escherichia coli cells
Akito Nishizawa, Miki Nakayama, Takuya Uemura, Yoshiyuki Fukuda, and Shigenobu Kimura
J. Biochem.

147/ 3, 433-443
2010/03

10.1093/jb/mvp187

Two-cistronic expression plasmids are useful for high-level expression of heterologous genes in Escherichia coli cells by preventing the inhibition of translational initiation. In the process of constructing a two-cistronic expression plasmid pCbSTCR-4 containing the fragments of the porcine cytochrome b5 (Psb5) and NADPH-cytochrome P450 reductase (PsCPR) genes as the first and second cistrons, respectively, the presence of a specific region in the first cistron that lowered the accumulation level of the PsCPR was suggested (Kimura, S. et al. (2005) J. Biochem. 137, 523–533). In this study, a disturbing nucleotide sequence similar to a Shine-Dalgarno (SD) sequence (SD-like sequence), AGGAG, was identified at the 5'-upstream region near the SD-sequence for the second cistron. Silent mutations in the SD-like sequence that lowered the similarity to a typical SD-sequence, increased the accumulation level of PsCPR. SD-like sequences introduced into mono-cistronic expression plasmids for the Psb5 and PsCPR genes also decreased the accumulation level of these proteins. The SD-like sequence also decreased the accumulation level of the insoluble PsCPR protein. This type of ribosome-binding site interference is useful not only for precise control of protein accumulation, but also for increasing the soluble form of recombinant proteins in E. coli cells.
3 (MISC)総説・解説(学術雑誌)
共著
Redox control of protein conformation in flavoproteins.
Toshiya Senda, Miki Senda, Shigenobu Kimura, Tetsuo Ishida
Antioxidants & Redox Signaling

11/ 7, 1741-1766
2009

10.1089

Flavin adenine dinucleotide (FAD) and flavin mononucleotide (FMN) are two flavin prosthetic groups utilized as the redox centers of various proteins. The conformations and chemical properties of these flavins can be affected by their redox states as well as by photoreactions. Thus, proteins containing flavin (flavoproteins) can function not only as redox enzymes, but also as signaling molecules by using the redox- and/or light-dependent changes of the flavin. Redox and light-dependent conformational changes of flavoproteins are critical to many biological signaling systems. In this review, we summarize the molecular mechanisms of the redox-dependent conformational changes of flavoproteins and discuss their relationship to signaling functions. The redox-dependent (or light-excited) changes of flavin and neighboring residues in proteins act as molecular gswitchesh that gturn onh various conformational changes in proteins, and can be classified into five types. On the basis of the present analysis, we recommend future directions in molecular structural research on flavoenzymes and related proteins.
4 研究論文(学術雑誌)
共著
Molecular mechanism of the redox-dependent interaction between NADH-dependent ferredoxin reductase and Rieske-type [2Fe-2S] ferredoxin.
Miki Senda, Shinya Kishigami, Shigenobu Kimura, Masao Fukuda, Tetsuo Ishida, Toshiya Senda
J.Mol.Biol.

373/ 2, 382-400
2007/10/19

10.1016/j.jmb.2007.08.002

The electron transfer system of the biphenyl dioxygenase BphA, which is derived from Acidovorax sp. (formally Pseudomonas sp.) strain KKS102, is composed of a FAD-containing NADH-ferredoxin reductase (BphA4) and a Rieske-type [2Fe-2S] ferredoxin (BphA3). Biochemical studies have suggested that the whole electron transfer process from NADH to BphA3 comprises three consecutive elementary electron-transfer reactions, in which BphA3 and BphA4 interact transiently in a redox-dependent manner. Initially, BphA4 receives two electrons from NADH. The reduced BphA4 then delivers one electron each to the [2Fe-2S] cluster of the two BphA3 molecules through redox-dependent transient interactions. The reduced BphA3 transports the electron to
BphA1A2, a terminal oxygenase, to support the activation of dioxygen for biphenyl dihydroxylation. In order to elucidate the molecular mechanisms of the sequential reaction and the redox-dependent interaction between BphA3 and BphA4, we determined the crystal structures of the productive BphA3-BphA4 complex, and of free BphA3 and BphA4 in all the redox states occurring in the catalytic cycle. The crystal
structures of these reaction intermediates demonstrated that each elementary electron transfer induces a series of redox-dependent conformational changes in BphA3 and
BphA4, which regulate the interaction between them. In addition, the conformational changes induced by the preceding electron transfer seem to induce the next electron
transfer. The interplay of electron transfer and induced conformational changes seems to be critical to the sequential electron-transfer reaction from NADH to BphA3.
5 研究論文(学術雑誌)
共著
Two-citronic expression plasmids for high-level gene expression in Escherichia coli preventing translational initiation inhibition caused by the intramolecular local secondary structure of mRNA.
Shigenobu Kimura, Tomoka Umemura, Takashi Iyanagi
J. Biochem.

137/ 4, 523-533
2005



大腸菌での異種蛋白質遺伝子発現において、mRNAのリボソーム結合部位の分子内二次構造による翻訳阻害阻害を回避する目的で、2-シストロン性の高発現プラスミドpCP1及びpCP2を作製し、ブタ肝臓P450還元酵素遺伝子等を用いて、その有用性を確認した。
6 研究論文(学術雑誌)
共著
Tolerance of the Rieske-type [2Fe-2S] cluster in recombinant ferredoxin BphA3 from Pseudomonas sp. KKS102 to histidine ligand mutations.
Shigenobu Kimura, Akihiro Kikuchi, Toshiya Senda, Yoshitsugu Shiro, Masao Fukuda
Biochem. J.

388/ 3, 869-878
2005



Pseudomonas sp. KKS102由来Rieske型フェレドキシンBphA3の大腸菌での高発現系を構築した。Rieske型[2Fe-2S]鉄イオウクラスターの配位His残基のアミノ酸残基置換に対する許容性をしらべ、Cysへの置換が可能であることを明らかにした。
7 研究論文(学術雑誌)
共著
Role of Thr66 in porcine NADH-cytochrome b5 reductase in catalysis and control of the rate-limitting step in electron transfer.
Shigenobu Kimura, Masanori Kawamura, Takashi Iyanagi
J. Biol. Chem.

278/ 6, 3580-3589
2003



ブタ肝臓NADH-シトクロムb5還元酵素中のFADのイソアロキサジン環のN5近傍に位置するThr66を系統的に置換して、電子伝達機能変化を、ストップトフロー法によって詳細に解析した。その結果、Thr66が本酵素の1電子還元状態である2種類のセミキノン中間体の安定性の制御に重要な役割を果たしてことを明らかにした。また、本酵素の新規触媒サイクルモデルを提案した。
8 研究論文(学術雑誌)
共著
High-level expression of porcine liver cytochrome P-450 reductase catalytic domain in Escherichia coli by modulating the predicted local secondary structure of mRNA.
Shigenobu Kimura, Takashi Iyanagi
J. Biochem.

134/ 3, 403-413
2003



ブタ肝臓P450還元酵素可溶性酵素ドメイン遺伝子の大腸菌での発現が、mRNAのリボソーム結合部位(RBS)を含む領域の分子内二次構造形成によって、翻訳開始段階で大きく阻害されることを見出した。また、mRNAの局所的二次構造形成能を変化させるサイレント変異の導入が、大腸菌での異種蛋白質遺伝子の発現量を制御する上で有効な手段であることを明らかにした。
9 研究論文(学術雑誌)
共著
Thermostabilization of Escherichia coli ribonuclease HI by replacing left-handed helical Lys95 with Gly or Asn
Shigenobu Kimura, Shigenori Kanaya, Haruki Nakamura
J. Biol. Chem.

267, 22014-22017
1992



大腸菌RNaseHの91-95位のアミノ酸配列を好熱菌型にした変異酵素の熱安定化がLys95→Glyの1アミノ残基置換によること、また、Lys95→Asnの置換でも安定化することを明らかにした。Lys95の主鎖は左巻きヘリックス型のコンフォメーションをとっており、左巻きヘリックス型コンフォメーションの許容性と安定化の間に相関が見られた。この結果から、「左巻きヘリックス型コンフォメーションをとるアミノ酸残基のGly又はAsnへの置換」という一般的な安定化手法を提唱した。
10 研究論文(学術雑誌)
共著
Stabilization of Escherichia coli ribonuclease HI by strategic replacement of amino acid residues with those from the thermophilic counterpart
Shigenobu Kimura, Haruki Nakamura, Tomoko Hashimoto, Motohisa Oobatake, Shigenori Kanaya
J. Biol. Chem.

267, 21535-21542
1992



好熱菌RNaseHの部分アミノ酸配列を大腸菌RNaseHに導入したキメラ酵素を系統的に作製して安定性の変化をしらべ、大腸菌RNaseHを安定化する4領域のアミノ酸残基置換を選び出した。これら4領域のアミノ酸残基置換を組み合わせることによって変異酵素が累加的に安定化することを見い出し、好熱菌RNaseHが局所的な安定化を組み合わせて高い熱安定性を獲得していることを明らかにした。また、個々の領域を置換した変異酵素の安定化機構についても考察した。
11 研究論文(学術雑誌)
共著
HPLC-spectrophotometric detection of trace heavy metals
via ‘Cascade’ separation and concentration
Gen Okano, Shukuro Igarashi, Yuhei Yamamoto, Shotaro Saito,
Yoshitaka Takagai, Takao Ohtomo, Shigenobu Kimura, Osamu Ohno, Yoshio Oka
Int. J. Environ. Anal. Chem.

95/ 2, 135-144
2015

10.1080/03067319.2014.994619


12 研究論文(学術雑誌)
共著
High-resolution crystal structures of the solubilized domain of porcine cytochrome b5
Yu Hirano, Shigenobu Kimura, Taro Tamada
Acta Crystallographica Section D Biol. Crystallogr.

71, 1572-1581
2015/07/01




13 研究論文(学術雑誌)
共著
小型エバポレーターを用いる金属錯体の一滴濃縮法の改良とHPLCへの応用
岡野 元,山本 悠平,木村 成伸,岡 圭男,五十嵐 淑郎
分析化学

62/ 8, 751-754
2013




14 研究論文(学術雑誌)
共著
Elucidations of the catalytic cycle of NADH-­cytochrome b5 reductase by X-­Ray crystallography: New insights into regulation of efficient electron transfer
Mitsugu Yamada, Taro Tamada, Kazuki Takeda, Fumiko Matsumoto, Hiraku Ohno, Masayuki Kosugi, Kiyofumi Takaba, Yoshinari Shoyama, Shigenobu Kimura, Ryota Kuroki, Kunio Miki
J.Mol.Biol.

425/ 22, 4295-4306
2013/11/15

10.1016/j.jmb.2013.06.010

NADH-cytochrome b5 reductase (b5R), a flavoprotein consisting of NADH- and FAD-domains, catalyzes electron transfer from the two-electron carrier NADH to the one-electron carrier cytochrome b5 (Cb5). The crystal structures of both the fully reduced and oxidized forms of porcine liver b5R were determined. In the reduced b5R structure determined at 1.68 Å resolution, the relative configuration of the two domains was slightly shifted in comparison with that of the oxidized form. This shift resulted in an increase in the solvent-accessible surface area of FAD, and created a new hydrogen bonding interaction between the N5 atom of the isoalloxazine ring of FAD and the hydroxyl oxygen atom of Thr66, which is considered to be a key residue in the release of a proton from the N5 atom. The isoalloxazine ring of FAD in the reduced form is flat as in the oxidized form, and stacked together with the nicotinamide ring of NAD+. Determination of the The oxidized b5R structure, including the hydrogen atoms, determined at 0.78 Å resolution revealed the details of a hydrogen bonding network from the N5 atom of FAD to His49 via Thr66. Both of the reduced and oxidized b5R structures explain how backflow in this catalytic cycle is prevented and the transfer of electrons to one-electron acceptors such as Cb5 is accelerated. Furthermore, crystallographic analysis by the cryo-trapping method suggests that re-oxidation follows a two-step mechanism. These results provide structural insights into the catalytic cycle of b5R.
15 研究論文(学術雑誌)
共著
Volatile organic compounds derived from 2-keto-acid decarboxylase in Microcystis aeruginosa
Masateru Hasegawa, Akito Nishizawa, Kiyomi Tsuji, Shigenobu Kimura, Ken-ichi Harada
Microbes and Environment

27/ 4, 525-528
2012/10/05

10.1264/jsme2.ME12099


16 研究論文(学術雑誌)
共著
Expression, purification and characterization of
human PHD1 in Escherichia coli
Xian Y. Li, Chikahisa Takasaki, Yuhei Satoha, Shigenobu Kimura, Ken-ichi Yasumoto, Kazuhiro Sogawa
J. Biochem.

144/ 5, 555-561
2008



The hypoxia-inducible factors (HIFs) play a central role in oxygen homeostasis. HIF prolyl hydroxylases (PHDs) modify HIFalpha subunits and thereby target them for proteasomal degradation. Mammalian PHDs comprise three isozymes, PHD1, PHD2 and PHD3, and belong to the iron(II)-2-oxoglutarate-dependent dioxygenase family. We have expressed full-length human PHD1 in Escherichia coli, and purified it to apparent homogeneity by immobilized Ni-affinity chromatography, cation-exchange HPLC followed by gel filtration. Fe(2+) was found to have EC(50) value of 0.64 microM and the purified enzyme showed maximal activity at 10 microM Fe(2+). The IC(50) values for transition metal ions, Co(2+), Ni(2+) and Cu(2+), were 58, 35 and 220 microM, respectively, in the presence of 100 microM Fe(2+). Mn(2+) did not affect the activity <1 mM. Many transcription-related proteins are regulated by phosphorylation. Thus, recombinant PHD1 was examined for in vitro phosphorylation using protein kinase A, protein kinase Calpha, casein kinase I and II and Erk2. The protein was most strongly phosphorylated by protein kinase Calpha, and the phosphorylation sites were found to be Ser-132, Ser-226 and Ser-234. Mutation of Ser-132 or Ser-234 to Asp or Glu diminished the enzymatic activity to 25-60%, while mutation of Ser-226 scarcely influenced the activity.
17 (MISC)総説・解説(国際会議プロシーディングズ)
共著
Modulation of the explession level of NADH-cytochrome P450 reductase catalytic domain.
Shigenobu Kimura, Akito Nishizawa, Takuya Umemura, Yoshiyuki Fukuda, Chiaki Sano, Eri Ueno
Flavins and Flavoproteins 2008 (Fargo, S., Gomez-Moreno, C., Medina, M.) Prensas Universitarias de Zaragoza, Spain

583-588
2008/06/08




18 (MISC)総説・解説(国際会議プロシーディングズ)
共著
Inversion of NADH/NADPH-specificity of BphA4 from Pseudomonas sp. strain KKS102 by substitutions of Glu175 and Gln177.
Akito Nishizawa, Daisuke Muramatsu, Shigenobu Kimura, Shinya Kishigami, Miki Senda, Toshiya Senda, Masao Fukuda
Flavins and Flavoproteins 2008 (Fargo, S., Gomez-Moreno, C., Medina, M.) Prensas Universitarias de Zaragoza, Spain

273-278
2008/06/08




19 (MISC)総説・解説(国際会議プロシーディングズ)
共著
Molecular mechanism of the redox-depsndent interaction between NADH-dependent ferredoxin reductase and Rieske-type [2Fe-2S]ferredoxin.
Miki Senda, Shigenobu Kimura, Masao Fukuda, Tetsuo Ishida, Toshiya Senda
Flavins and Flavoproteins 2008 (Fargo, S., Gomez-Moreno, C., Medina, M.) Prensas Universitarias de Zaragoza, Spain

113-118
2008/06/08




20 研究論文(学術雑誌)
共著
Crystallization and preliminary X-ray analysis of the electron-transfer complex of Rieske-type [2Fe–2S] ferredoxin and NADH-dependent ferredoxin reductase derived from Acidovorax sp. strain KKS102
Miki Senda, Shinya Kishigami, Shigenobu Kimura, and Toshiya Senda
Acta Crystallograph. Sect F Struct. Biol. Cryst. Commun.

F63, 520-523
2007

doi: 10.1107/S1744309107023007

The electron-transfer complex of BphA3, a Rieske-type [2Fe–2S] ferredoxin, and BphA4, a NADH-dependent ferredoxin reductase, was crystallized using the sitting-drop vapour-diffusion method under anaerobic conditions. The obtained crystals were analyzed by SDS–PAGE, which showed that they contained both BphA3 and BphA4. The crystals belong to space group P21,with unit-cell parameters a = 60.60, b = 173.72, c = 60.98 A ̊,
21 研究論文(学術雑誌)
共著
Mechanistic studies on the intramolecular one-electron transfer between the two flavins in the human endothelial NOS reductase domain.
Nishino, Y., Yamamoto, K., Kimura, S., Kikuchi, A., Shiro, Y. and Iyanagi, T.
Arch.Biochem.Biophys.

465/ 1, 254-265
2007/09/01



The object of this study was to clarify the mechanism of electron transfer in the human endothelial nitric oxide synthase (eNOS) reductase domain using recombinant eNOS reductase domains; the FAD/NADPH domain containing FAD- and NADPH-binding sites and the FAD/FMN domain containing FAD/NADPH-, FMN-, and a calmodulin-binding sites. In the presence of molecular oxygen or menadione, the reduced FAD/NADPH domain is oxidized via the neutral (blue) semiquinone (FADH()), which has a characteristic absorption peak at 520nm. The FAD/NADPH and FAD/FMN domains have high activity for ferricyanide, but the FAD/FMN domain has low activity for cytochrome c. In the presence or absence of calcium/calmodulin (Ca(2+)/CaM), reduction of the oxidized flavins (FAD-FMN) and air-stable semiquinone (FAD-FMNH()) with NADPH occurred in at least two phases in the absorbance change at 457nm. In the presence of Ca(2+)/CaM, the reduction rate of both phases was significantly increased. In contrast, an absorbance change at 596nm gradually increased in two phases, but the rate of the fast phase was decreased by approximately 50% of that in the presence of Ca(2+)/CaM. The air-stable semiquinone form was rapidly reduced by NADPH, but a significant absorbance change at 520nm was not observed. These findings indicate that the conversion of FADH(2)-FMNH() to FADH()-FMNH(2) is unfavorable. Reduction of the FAD moiety is activated by CaM, but the formation rate of the active intermediate, FADH()-FMNH(2) is extremely low. These events could cause a lowering of enzyme activity in the catalytic cycle.
22 研究論文(学術雑誌)
共著
Crystallization and preliminary X-ray analysis of the Rieske-type [2Fe-2S] ferredoxin component of biphenyl dioxygenase from Pseudomonas sp. strain KKS102.
Miki Senda, Shigenobu Kimura, Shinya Kishigami, Toshiya Senda
Acta Crystallograph. Sect F Struct. Biol. Cryst. Commun.

62/ 6, 590-592
2006/06/01



BphA3, a Rieske-type [2Fe-2S] ferredoxin component of a biphenyl dioxygenase (BphA) from Pseudomonas sp. strain KKS102, was crystallized by the hanging-drop vapour-diffusion method. Two crystal forms were obtained from the same conditions. The form I crystal belongs to space group P2(1)2(1)2, with unit-cell parameters a = 26.3, b = 144.3, c = 61.5 A, and diffracted to 2.45 A resolution. The form II crystal belongs to space group P2(1)2(1)2(1), with unit-cell parameters a = 26.2, b = 121.3, c = 142.7 A, and diffracted to 2.8 A resolution. A molecular-replacement calculation using BphF as a search model yielded a satisfactory solution for both forms.
23 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
Two-cistronic high-level expression of cytochrome P450 reductase solubilized domain by preventing the formation of unfavorable intramolecular local secondary structure of mRNA
Shigenobu Kimura, Tomoka Umemura, Takashi Iyanagi
Flavins and Flavoproteins 2005 (Nishino, T., Miura, R., Tanokura, M., Fukui, K.) ARchiTect Inc., Tokyo

681-686
2005



大腸菌での異種蛋白質遺伝子発現において、mRNAのリボソーム結合部位の分子内二次構造による翻訳阻害阻害を回避する目的で、2-シストロン性の高発現プラスミドpCP1及びpCP2を作製し、ブタ肝臓P450還元酵素遺伝子等を用いて、その有用性を確認した。
24 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
High-resolution crystal structure of a ferredoxin reductase, BphA4
Miki Senda, Shinya Kishigami, Shigenobu Kimura, Masao Fukuda, Toshiya Senda
Flavins and Flavoproteins 2005 (Nishino, T., Miura, R., Tanokura, M., Fukui, K.) ARchiTect Inc., Tokyo

521-526
2005



Pseudomonas sp. KKS102由来BphA4の触媒サイクル中の反応中間体に対応する野生型と変異体の酸化型-NAD複合体、還元型-NADH複合体を結晶中で作製して高解像度のX-線結晶構造解析を行った。
25 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
Effects of the mutations of Ser52, Lys53, and Glu159 in BphA4 from Pseudomonas sp. strain KKS102 on electron transfer
Shinya Kishigami, Mina Yamazaki, Toshiya Senda, Masao Fukuda, Shigenobu Kimura
Flavins and Flavoproteins 2005 (Nishino, T., Miura, R., Tanokura, M., Fukui, K.) ARchiTect Inc., Tokyo

509-514
2005



野生型Pseudomonas sp. KKS102由来BphA4及び
活性中心近傍に位置するSer52, Lys53及びGlu159を系統的に置換した変異体10種についてその電子伝達機能を解析した。その結果、野生型酵素では、触媒サイクル中の律速段階がFADの青色セミキノンの変換過程にあること、Ser52及びLys53が青色セミキノンの安定性に重要であること、並びに、Glu159がNADHのニコチンアミド部分の配向制御に重要であることを明らかにした。
26 研究論文(学術雑誌)
共著
Interflavin one-electron transfer in the inducible nitric oxide synthase reductase domain and NADPH-cytochrome P450 reductase.
Keita Yamamoto, Shigenobu Kimura, Yoshitsugu Shiro, Takashi Iyanagi
Arch. Biochem. Biophys.

440/ 1, 65-78
2005



ヒト誘導型iNOSの全長及びフラビンドメイン内でのFAD-FMN間の電子伝達を解析し、NADPH-シトクロムP450還元酵素(CPR)におけるFAD-FMN間の電子伝達と比較した。その結果、iNOS、CPRいずれの場合にも反応性が低い青色セミキノン型FMNラジカルがFAD-FMN間の1電子伝達を可能にしていることが示唆された。この結果をもとに、CaM結合型iNOSフラビンドメインとCPRの触媒サイクルに関する一般的なモデルを提案した。
27 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
Two-cistronic high-level expression of porcine liver cytochrome P450 reductase solubilized domain in Escherichia coli
Shigenobu Kimura, Tomoka Umemura, Takashi Iyanagi
The 1st pacific-rim international conference on protein science. Program and Abstract

111
2004



mRNAの分子内二次構造形成による翻訳開始阻害を回避できる2-シストロン性の発現プラスミドを作製し、その有用性を野生型ブタ肝臓P450還元酵素可溶性酵素ドメイン遺伝子を用いて示した。
28 研究論文(学術雑誌)
共著
Human neuronal nitric oxide synthase can catalyze one-electron reduction of adriamycin: role of flavin domain.
Fu, J., Yamamoto, K., Guan, Z.-W., Kimura, S., and Iyanagi, T.
Arch. Biochem. Biophys.

427/ 2, 180-187
2004



ヒト神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)全長とフラビンドメインよるアドリアマイシン(Adr)の1電子還元機構を解析し、Ca2+結合型カルモジュリンが、FAD、FMN間の電子伝達を加速することによって、2電子還元状態のFMNによるAdrの還元速度が増加することを明らかにした。
29 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
The intermolecular one-electron transfer between the two flavins in iNOS reductase domain and cytochrome P450 reductase.
Yamamoto, K., Guan, Z.-W., Nishino, Y., Kimura, S., and Iyanagi, T.
Cytochromes P450, Biochemistry, Biophysics and Drag Metabolism (Anzenbacher, P. and Hudecek, J., eds) Monduzzi Editore, Bologna

341-345
2003



誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)還元酵素ドメインとシトクロムP450還元酵素ドメイン中のFADとFMN間の分子内1電子伝達反応を、ストップトフロー法を用いて解析した。FADとFMN両セミキノンのメナジオン(MD)に対する低い反応性がFAD-FMN間の分子内1電子反応を可能にしており、FMNH&#8226;/FMNH2が触媒サイクル中最も反応性の高い酸化還元対であることが示唆された。
30 研究論文(国際会議プロシーディングス)

Human endotherial nitric oxide synthase reductase domain is activated by calmodulin and phosphorylation.
8. Nishino, Y., Yamamoto, K., Guan, Z.-W., Kimura, S., and Iyanagi, T.
Cytochromes P450, Biochemistry, Biophysics and Drag Metabolism (Anzenbacher, P. and Hudecek, J., eds) Monduzzi Editore, Bologna

267-272
2003



ヒト血管内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS)の還元酵素ドメインのカルシウム結合型カルモジュリン(Ca2+/CaM)による活性化機構を解析し、Ca2+/CaMがFADの還元速度と、FADからFMNへの分子内1電子伝達速度の両方を加速することを明らかにした。また、リン酸化された酵素を模倣した変異体S633DおよびS1177DのFAD-FMN間の分子内1電子伝達速度も増加することを見いだした。
31 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
High-level expression of porcine P450 reductase solubilized domain in Escherichia coli by modulating local secondary structure of mRNA.
Kimura, S., and Iyanagi, T.
Cytochromes P450, Biochemistry, Biophysics and Drag Metabolism (Anzenbacher, P. and Hudecek, J., eds) Monduzzi Editore, Bologna

217-222
2003



ブタ肝臓P450還元酵素可溶性酵素ドメイン遺伝子の大腸菌での発現が、mRNAのリボソーム結合部位(RBS)を含む領域の分子内二次構造形成によって、翻訳開始段階で大きく阻害されることを見出した。また、大腸菌での異種蛋白質遺伝子の発現量を制御する上で、サイレント変異を導入してmRNAの局所的二次構造形成能を変化させることが有用であることを論じた。
32 研究論文(学術雑誌)
共著
Mechanistic studies on the intermolecular one-electron transfer between the two flavins in the human nNOS and iNOS flavin domains.
Zhi-Wen Guan, Daiki Kamatani, Shigenobu Kimura, Takashi Iyanagi
J. Biol. Chem.

278/ 33, 30859-30868
2003



ヒト神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)と誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)のフラビンドメイン内でのFAD、FMN間の電子伝達機能をストップトフロー法を用いて解析し、比較した。その結果、iNOSフラビンドメインでは、FAD、FMN間の電子伝達速度が速く、活性型の2電子還元型FMN(FMNH2)が形成されやすいことを明らかにした。
33 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
Mechanistic studies on the intermolecular one-electron transfer between the two flavins in the human nNOS and iNOS flavin domains.
Guan, Z. -W., Kamatani, D., Nishino, Y., Matsuda, H., Kimura, S., and Iyanagi, T.
Flavins and Flavoproteins 2002 (Chapman, S., Perham, R., and Scrutton, N., eds) Agency for Scientific Publ., Berlin

563-568
2002



ヒト神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)と誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)のフラビンドメイン内でのFAD、FMN間の電子伝達機能をストップトフロー法を用いて解析し、比較した。iNOSフラビンドメインではFAD、FMN間の電子伝達速度が速く、活性型の2電子還元型FMN(FMNH2)が形成されやすいことを明らかにするとともに、カルシウム結合型カルモジュリンによるnNOSフラビンドメインの活性化機構について論じた。
34 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
Catalytic cycles and rate-limiting steps of the Thr66-substituted porcine liver NADH-cytochrome b5 reductase catalytic domains.
Kimura, S., Kawamura, M., and Iyanagi, T.
Flavins and Flavoproteins 2002 (Chapman, S., Perham, R., and Scrutton, N., eds) Agency for Scientific Publ., Berlin

575-580
2002



ブタ肝臓NADH-シトクロムb5還元酵素可溶性酵素ドメイン中のThr66を系統的に置換して、変異酵素の電子伝達機能変化をストップトフロー法によって詳細に解析した。本酵素の2種類のセミキノン中間体の安定性の制御にThr66が重要な役割を果たしてことを明らかにし、本酵素の新規触媒サイクルモデルを提案した。
35 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
One-electron reduction of quinines by the neuronal nitric oxide synthase reductase domain.
Kitamura, M., Matsuda, H., Kimura, S., and Iyanagi, T.
Advance Experimental Medicine and Biology

500, 323-326
2001



ラット神経型一酸化窒素合成酵素フラビンドメインによる種々のキノン類の1電子還元速度を系統的に解析し、キノン類の還元電位と反応速度との相関性について論じた。
36 研究論文(学術雑誌)
共著
Effect of flavin-binding motif amino acid mutations in the NADH-cytochrome b5 reductase catalytic domain on protein stability and catalysis.
Shigenobu Kimura, Hirokazu Nishida, Takashi Iyanagi
J. Biochem.

130/ 4, 481-490
2001



ブタ肝臓NADH-シトクロムb5還元酵素のRXY(T/S)+(T/S)フラビン結合モチーフ中のArg63、Tyr65、及びSer99を系統的に置換し、Arg63側鎖正電荷及びSer99側鎖水酸基がFADの結合だけでなくNADH、NAD+との親和性にも重要であることと、Tyr65側鎖とFADのイソアロキサジン環との相互作用が本酵素の安定性と電子伝達機能に重要であることを明らかにした。
37 研究論文(学術雑誌)
共著
One-electron reduction of quinones by the neuronal nitric-oxide synthase reductase domain.
Matsuda, H., Kimura, S., and Iyanagi, T.
Biochim. Biophys. Acta

1459/ 1, 106-116
2000



神経型一酸化窒素合成酵素(nNOS)のFAD、FAD結合ドメイン、カルモジュリン結合領域を含む還元酵素ドメインについて、キノン類の1電子還元活性と、Ca2+結合型カルモジュリン(Ca2+/CaM)による活性化機構をしらべた。メナジオン還元中、本酵素ドメインは、1電子還元状態と3電子還元状態間で機能しており、Ca2+/CaMの存在下でのキノンの還元速度の増加が、2つのフラビン間での電子交換の加速によることを示した。
38 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
Calmodulin activates intramolecular electron transfer between the two flavines of neuronal nitric-oxide synthase reduction domain.
Matsuda, H., Kimura, S., and Iyanagi, T.
Flavins and Flavoproteins 1999 (Ghisla, S., Kroneck, P., Macheroux, P., and Sund, H., eds.) Agency for Scientific Publ., Berlin

171-174
1999



ラット神経型一酸化窒素合成酵素フラビンドメインの1電子還元中間体の酸化還元活性、シトクロムcおよびフェリシアン酸イオンの還元活性へのカルシウム結合型カルモジュリン(Ca2+/CaM)の影響を解析し、Ca2+/CaMによるFMN-FAD間の電子伝達の加速について論じた。
39 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
Mechanic studies on the one-electron reduction of quinones by neuronal nitric-oxide reductase domain.
Matsuda, H., Kimura, S., and Iyanagi, T.
Flavins and Flavoproteins 1999 (Ghisla, S., Kroneck, P., Macheroux, P., and Sund, H., eds.) Agency for Scientific Publ., Berlin

167-170
1999



カルモジュリン結合部位とFMN、FAD結合部位を含むラット神経型一酸化窒素合成酵素フラビンドメインが、キノン類の1電子還元活性が、カルシウム結合型カルモジュリンによって加速されることを示すとともに、 FMN-FADペアの役割について論じた。
40 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
Amino acid substitutions near the FAD in NADH-cytochrome b5 reductase: roles of Arg63 and Thr66 in the electron transfer.
Kimura, S., Kawamura, M., and Iyanagi, T.
Flavins and flavoproteins 1999 (Ghisla, S., Kroneck, P., Macheroux, P., and Sund, H., eds.) Agency for Scientific Publ., Berlin

207-210
1999



ブタ肝臓NADH-シトクロムb5還元酵素のFAD結合モチーフアミノ酸残基であるArg63とThr66をそれぞれ置換した変異酵素の電子伝達機能変化を解析し、Arg63側鎖の正電荷がNADHとの親和性に重要であること、Thr66側鎖水酸基がFADセミキノンの制御への関与について論じた。
41 研究論文(学術雑誌)
共著
Systematic mutations of highly conserved His49 and carboxyl-terminal of recombinant porcine liver NADH-cytochrome b5 reductase solubilized domain.
Kimura, S., Emi, Y., Ikushiro, S. and Iyanagi, T.
Biochim. Biophys. Acta

1430/ 2, 290-301
1999



ブタ肝臓NADH-シトクロムb5還元酵素可溶性酵素ドメイン遺伝子の大腸菌を用いた大量発現系を構築した。FADのイソアロキサジン環近傍の保存性の高いHis49とC末端のPhe272を系統的に置換した変異体を作製して、電子伝達機能変化をしらべた。その結果、His49とC末端カルボキシル基は電子伝達機能に必須ではないものの、変異導入による変異部位近傍の静電的な環境変化が、シトクロムb5の認識に影響を与えることを示した。
42 研究論文(学術雑誌)
共著
Chemical modification of rat hepatic microsomes with N-ethylmaleimide results in activation of both UDP-N-acetylglucosamine-dependent stimulation of glucuronidation and UDP-glucronic acid uptake.
Ikushiro, S., .Emi, Y., Kimura, S., and Iyanagi, T.
Biochim. Biophys. Acta

1428/ 2-3, 388-396
1999



ラット肝ミクロソームをシステイン残基の特異的修飾試薬であるN-エチルマレイミド(NEM)で処理し、UDP-グルクロン酸転移酵素(UGT)活性の変化をしらべた。その結果、NEMによって修飾されるシステイン残基が、グルクロニル化とUDP-グルクロン酸の取り込みの両方に関係している可能性を示した。
43 研究論文(学術雑誌)
共著
Three-dimensional structure of Abrin-a A-chain having ribosome inactivating activity
Khono, T., Senda, T., Narumi, H., Kimura, S., Mitsui, Y.
Proc. Japan. Acad. Sci.

71B, 104-107
1995



遺伝子組換え型アブリン-a A-鎖のX線結晶構造解析を行った。アブリン-a A鎖はヒマ種子中に存在するリシンのA鎖との立体構造の類似性について考察した。
44 研究論文(学術雑誌)
共著
Crystallization and preliminary crystallographic analysis of recombinant Abrin-a A-chain having ribosome inactivating activity
Khono, T., Senda, T., Narumi, H., Kimura, S. , Mitsui, Y.
Proteins

23/ 1, 126-127
1995



アブリン-aはトウアズキ種子に存在するII型のリボソーム不活化タンパクである。遺伝子組換え型アブリン-a A-鎖の結晶化を行い、空間群及び格子定数を決定した。
45 研究論文(学術雑誌)
共著
Structural study of Escherichia coli ribonuclease HI with enhanced thermostability
Kohki Ishikawa, Shigenobu Kimura, shigenori Kanaya, Kosuke Morikawa, Haruki Nakamura
Protein Engineering

6/ 1, 85-91
1993



アミノ酸残基置換によって安定化した大腸菌RNaseHの変異酵素3種(H62P、K95G、K95N)及び関連変異酵素2種(H62A、K95A)のX線結晶解析を行った。解析結果に基づいてそれぞれの安定化変異酵素の安定化機構を考察した。
46 研究論文(学術雑誌)
共著
Crystal structure of ribonuclease H from Thermus thermophilus HB8 refined at 2.8 A resolution
Ishikawa, K., Okumura, M., Katayanagi, K., Kimura, S., Nakamura, H., Morikawa, K.
J. Mol. Biol.

230/ 2, 529-542
1993



X線結晶解析により高度好熱菌Thermus thermophilus HB8 株由来RNaseHの立体構造を2.8Å分解能で解明した。大腸菌RNaseHの立体構造との比較から、好熱菌RNaseHの耐熱化機構について論じた。
47 研究論文(学術雑誌)
共著
Cooperative stabilization of Escherichia coli ribonuclease HI by insertion of Gly-80b and Gly-77 Ala substitution
Kohki Ishikawa, Haruki Nakamura, Kosuke Morikawa, Shigenobu Kimura, Shigenori Kanaya
Biochemistry

32/ 28, 7136-7142
1993



大腸菌RNaseHの80位と81位の間にGly残基を挿入した安定化変異酵素G80b-RNaseH、Gly77をAlaに置換した安定化変異酵素A77-RNaseH、及び両者の変異を同時に導入した安定化変異酵素A77/G81b-RNaseHについてX線結晶構造解析を行った。変異酵素の安定化機構について考察し、Gly80b挿入によるpaper clip構造形成の安定化への寄与について論じた。
48 研究論文(大学,研究機関紀要)
共著
Three-dimentional structure of thermostable RNase H mutant from Escherichia coli.
Kawano, Y., Sasaki, H., Tanaka, I., Hikichi, K., Kimura, S., Kanaya, S., and Morikawa, K.
Report on Progress in Polymer physics in Japan

XXXV, 581-582
1992



大腸菌RNaseHのSer68をValに置換して安定化した変異酵素のX線結晶構造解析を行い、変異導入に伴う立体構造変化を解明した。安定化機構を変異部位近傍の構造変化に基づいて考察した。
49 研究論文(学術雑誌)

Stabilization of Escherichia coli ribonuclease H by introduction of an artificial disulfide bond.
Kanaya, S, Katsuda, C., Kimura, S., Nakai, T., Kitakuni, E., Nakamura, H., Katayanagi, K., Morikawa, K., and Ikehara, M.
J. Biol. Chem.

266/ 10, 6038-6044
1991



SS結合導入による大腸菌RNaseHの安定化効果をしらべるために、Asn44をCysに置換してCys13との間にSS結合を導入した。変異酵素は11.8℃安定化した。また、酵素力学的パラメータの解析からAsn44が基質結合部位に含まれることを示唆する結果を得た。SS結合導入による安定化の有用性と酵素活性への影響について論じた。
50 研究論文(学術雑誌)
共著
How does RNase H recognize a DNA&#183;RNA hybrid ?
Nakamura, H., Oda, Y., Iwai, S., Inoue, H., Ohtsuka, E., Kanaya, S., Kimura, S., Katsuda, C., Katayanagi, K., Morikawa, K., Miyashiro, H., and Ikehara M.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA

88/ 24, 11535-11539
1991



X線結晶構造解析によって得られた立体構造を基に、大腸菌RNaseHの酵素活性発現に直接関与する可能性のあるアミノ酸残基を推定した。それらのアミノ酸残基を置換した変異酵素を作製して酵素力学的パラメータを解析するとともに、基質であるDNA・RNAハイブリッドのNMRによるコンフォメーション解析を行った。得られた結果をもとに酵素基質複合体モデルを提案して本酵素の基質認識と触媒機構について考察した。
51 研究論文(学術雑誌)
共著
Effect of cavity-modulating mutations on the stability of Escherichia coli ribonuclease HI.
Kimura, S., Oda, Y., Nakai, T., Katayanagi, K., Kitakuni, E., Nakai, C., Nakamura, H., Ikehara, M., and Kanaya, S.
Eur. J. Biochem.

206/ 2, 337-343
1991



大腸菌RNaseHのSer68を側鎖の大きさ、形の異なる5種のアミノ酸残基に系統的に置換して分子表面のキャビティーを変化させ、安定性、立体構造、酵素活性への影響をしらべた。その結果Valへの置換で安定化がみられた。NMR、CDスペクトルによる解析結果と併せてアミノ酸置換と構造、安定性への影響について論じた。
52 研究論文(学術雑誌)
共著
Deletion of D-helix in bovine pancreatic phospholipase A2.
Kimura, S., Tanaka, T., Shimada, I., Shiratori, Y., Nakagawa, S., Nakamura, H., Inagaki, F., and Ota, Y.
Agric. Biol. Chem.

54/ 3, 633-639
1990



ウシ膵臓フォスフォリパーゼA2分子中の短いαヘリックス(D-helix)を欠失した変異酵素を設計、作成し、その機能・構造変化を解析し、D-helixの欠失は本酵素の基質との親和性には影響しないが、基質切断能力を低下させることを明らかにした。NMRにより解析した活性中心近傍の構造変化についても考察した。
53 研究論文(学術雑誌)
共著
Role of cysteine residues in ribonuclease H from Escherichia coli. Site-directed mutagenesis and chemical modification.
Kanaya, S., Kimura, S., Katsuda, C., and Ikehara, M.
Biochem. J.

271/ 1, 59-66
1990



大腸菌リボヌクレアーゼH(RNaseH)分子中の3残基のシステイン残基の酵素活性への関与について、部位特異的変異導入法及び化学修飾によって解析した。その結果、いずれのシステイン残基も酵素活性に必須ではないこと、Cys13及びCys133の化学修飾によって引き起こされる活性低下が導入基の立体障害によるものであることを明らかにした。
54 研究論文(学術雑誌)
共著
Stability of human interferon-β1: oligomeric human interferon-β1 is inactive but is reactivated by monomerization.
Utsumi, J., Yamazaki, S., Kawaguchi, K., Kimura, S., and Shimizu, H.
Biochim. Biophys. Acta

998/ 2, 167-172
1989



大腸菌で生産した遺伝子組み換え型ヒトインターフェロンβの多量体形成をゲル濾過HPLCで解析し、多量体形成が活性低下を引き起こすことを明らかにした。また、界面活性剤を用いて多量体を再活性化できることを示した。
55 研究論文(国際会議プロシーディングス)
共著
Secretion of pancreatic phospholipase A2 by Saccharomyces cerevisiae; Use of a chemically synthesized coding sequence.
Ota, Y., Tanaka, T., and Kimura, S.
Advances in Gene Technology: Protein Engineering and Production Proceedings of the 1988 Maiami Bio/Technology Winter Symposium

37
1988




56 研究論文(学術雑誌)
共著
Disulfide bond interchange in Escherichia coli-derived recombinant human interferon-β1 under denaturing conditions.
Kimura, S., Utsumi, J., Yamazaki, S., and Shimizu, H.
J. Biochem.

104/ 1, 44-47
1988



天然型及び大腸菌で生産した遺伝子組換え型ヒトインターフェロンβ分子中のSS結合の位置を決定するとともに、変性剤存在下で起こるSS結合の組み換えについて論じた。
57 研究論文(学術雑誌)
共著
Isolation, properties and amino acid sequences of a phospholipase A2 and its homologue without activity from the venom of a sea snake, Laticauda colubrina, from the Solomon Islands.
Takasaki, C., Kimura, S., Kokubun, Y., and Tamiya, N.
Biochem. J.

253/ 3, 869-875
1988



南太平洋ソロモン諸島に生息するアオマダラウミヘビ毒液中の有毒性フォスフォリパーゼA2とそのホモログタンパクについて全アミノ酸配列を決定し、その毒性、酵素活性、カルシウムイオンの結合等について、その特性を解析した。
58 研究論文(学術雑誌)
共著
Secretion of the proenzyme and active bovine pancreatic phospholipase A2 enzyme by Saccaromyces cerevisiae: design and use of a synthetic gene.
Tanaka, T., Kimura, S., and Ota, Y.
Gene

64/ 2, 257-264
1988



ウシ膵臓フォスフォリパーゼA2前駆体遺伝子を化学合成し、酵母を用いて培養液中に分泌発現する系を構築した。発現した遺伝子組換え型タンパクのN末端アミノ酸配列を解析し、大部分が前駆体として分泌され、トリプシン処理によって活性型酵素に変換することを確認した。
59 研究論文(学術雑誌)
共著
Characterization of E. coli-derived recombinant human interferon-β as compared with fibrobrast human interferon-β.
Utsumi, J., Yamazaki, S., Hosoi, K., Kimura, S., Hanada, K., Shimazu, T., and Shimizu, H
J. Biochem.

101/ 5, 1199-1208
1987



大腸菌で生産した遺伝子組み換え型ヒトインターフェロンβのアミノ酸配列、物理化学的性質を解析し、繊維芽細胞由来天然型ヒトインターフェロンβと比較し、その類似性と差異について論じた。
60 研究論文(学術雑誌)
共著
Sequence of a cDNA coding for bovine pancreatic phospholipase A2.
Tanaka, T., Kimura, S., and Ota, Y.
Nucleic Acids Res.

15/ 7, 3178
1987



ウシ膵臓からフォスフォリパーゼA2遺伝子をクローニングし、塩基配列を決定した。
61 研究論文(学術雑誌)
共著
Purification of murine macrophage colony-stimulating factor using hydroxyapatite high-performance liquid chromatography in the presence of sodium dodecylsulphate.
Utsumi, J., Kimura, S., Matsuda, S., and Shimizu, H.
J. Chromatography

421/ 2, 355-359
1987



SDSを添加したリン酸緩衝液でのハイドロキシアパタイトカラムHPLCを用いたマウスCSF(macrophage colony-stimulating factor)の精製法を見いだした。SDS添加効果と、精製したマウスCSFのN末端アミノ酸配列について論じた。
62 研究論文(学術雑誌)
共著
Determination of the complete amino acid sequence of recombinant human γ-interferon produced in Escherichia coli.
Yamazaki, S., Shimazu, T., Kimura, S., and Shimizu, H.
J. Interferon Res.

6/ 4, 331-336
1986



大腸菌で生産した遺伝子組み換え型ヒトインターフェロンγの全アミノ酸配列を決定し、C末端がプロセシングされていることを明らかにし、天然型との類似性と差異について論じた。