茨城大学
理工学研究科(工学野)
物質科学工学領域

教授

木村 成伸

キムラ シゲノブ
KIMURA Shigenobu

その他の所属・職名

  1. フロンティア応用原子科学研究センター

経歴

  1. 東レ株式会社基礎研究所 所員 1984/04-1986/03
  2. 蛋白工学研究所 研究員(出向) 1986/04-1992/03
  3. 東レ株式会社基礎研究所 研究員 1992/04-1996/09
  4. 姫路工業大学理学部生命科学科 助教授 1996/10-2002/03
  5. 姫路工業大学大学院理学研究科生命科学専攻 助教授(改組に伴う所属変更) 2002/04-2004/03
  6. 兵庫県立大学大学院生命理学研究科 助教授 (改組に伴う所属変更) 2004/04-2005/03
  7. 茨城大学工学部生体分子機能工学科 教授 2005/04-現在

学歴

  1. 東北大学大学院 理学研究科  化学第二専攻 博士課程前期2年の過程 1984 卒業
  2. 東北大学 理学部 化学科 1982 卒業 Japan
  3. 東北大学大学院 理学研究科 化学第二専攻 修士 1984 修了

学位

  1. 博士(理学)東北大学 東北大学 1994/01

教育・研究活動状況

電子伝達系蛋白質の構造と機能の研究
蛋白質工学の基盤技術研究とその応用

研究分野

  1. 構造生物化学
  2. 機能生物化学
  3. 環境技術・環境材料

研究キーワード

  1. タンパク質、蛋白質工学、電子伝達系、フラビン酵素、発現系、バイオレメディエーション

研究テーマ

  1. 電子伝達系蛋白質の構造と機能
  2. 遺伝子組換え型蛋白質生産のための遺伝子発現系の研究
  3. 環境分野への応用を目指した蛋白質工学的研究 電子伝達系酵素の基質特異性改変を行い、これをバイオレメディエーションに応用する。

競争的資金等の研究課題

  1. シアノバクテリアの細胞内電子供給系路の解明と新規芳香族化合物分解株の創成 科研費 基盤研究(B)一般 科研費 基盤研究B 2015/04/01-現在
  2. シアノバクテリアを利用した膜タンパク質大量生産系の構築 科研費 萌芽研究 科研費 挑戦的萌芽研究 2013/04/01-2016/03/31 細胞膜上にある膜タンパクは,細胞の代謝,物質輸送,信号伝達などに重要な役割を果たしている。膜タンパク分子の立体構造や機能解明を進めるためには,大量培養が容易な微生物を用いた遺伝子組換え型膜タンパクの大量生産系が必要である。本研究では,光合成微生物であるシアノバクテリア細胞内に豊富にあるチラコイド膜上の膜タンパクのN末端側ポリペプチドを利用して,遺伝子組換え型タンパクをチラコイド膜画分に産生できることを示すことができた。
  3. 貧栄養環境下で芳香族環境汚染物質を分解する新規光合成微生物の改良と展開 科研費 基盤研究(A)一般 文部科学省科学研究費補助金 2009/05/11-2013/03/31 シアノバクテリアSynechocystis sp. PCC6803にAcidovorax sp. KKS102株ビフェニル分解酵素系遺伝子やラット肝臓シトクロムP4501A1遺伝子を導入することにより,ビフェニルやダイオキシンを貧栄養環境下で水酸化できる新規シアノバクテリア株を作製した。芳香族環境汚染物質のバイオレメディエーションにおけるシアノバクテリアの有用性が確認できた。
  4. 貧栄養環境下でのPCB汚染除去のための新規光合成微生物の創出 科研費 基盤研究(B)一般 科研費 基盤研究B 2006/06/16-2009/03/31 水や土壌中などに残留するポリ塩化ビフェニル(PCB)の汚染除去には、ビフェニル分解微生物を用いた生物的環境浄化が有効である.本研究では、PCB 分解細菌Pseudomonas sp. KKS102 株の分解酵素系タンパク質BphA1~A4 遺伝子を光合成微生物であるシアノバクテリア(ラン藻)に組み込んで、これまで困難であった貧栄養環境下でも光エネルギーを用いてビフェニル化合物を分解できる新規光合成微生物を創出した.
  5. ブタ肝臓ミクロソーム電子伝達系生物マシーナリーの立体構造と機能に関する研究 科研費 特定領域研究(A) 生物マシーナリー 公募研究 1999/04/01-2001/03/31 1. ブタ肝臓由来NADH-シトクロムb5還元酵素(Pb5R)中に存在する、フラビン還元酵素ファミリーに共通に見られるフラビン結合モチーフ(RXY(T/S)+(T/S)モチーフ)アミノ酸残基置換変異体の電子伝達機能を解析して、本モチーフ中のArg63側鎖正電荷およびSer99側鎖水酸基がFADのみならずNADHとの結合にも重要であること、Arg63側鎖正電荷がシトクロムb5への特異的電子伝達に関与していることを明らかにした。また、Thr66置換変異体(T66A, S, V, N, D)のストップトフロー法による電子伝達機能の解析を行い、Thr66の置換が電子伝達中に生じるFADセミキノン分子種とその酸化速度に影響を与え、酵素反応サイクルの律速段階を変化させることを見いだした。 2.Pb5RのH49E変異体のX線結晶構造解析を終了し、H49Eの電子伝達機能変化が、FADを含む局所的な構造変化によることを明らかにした。

著書

  1. 貧栄養下で芳香族化合物を分解できる新規光合成微生物 西澤明人、千田美紀、千田俊哉、菓子野康浩、福田雅夫、木村成伸 ケミカルエンジニヤリング 2009/10/01
  2. 反応中間体構造から明らかになった電子伝達タンパク質間の酸化還元依存的な親和性調節機構 千田美紀, 木村成伸, 福田雅夫, 石田哲夫, 千田俊哉 日本結晶学会誌 2008/12 Redox-dependent affinity regulation is critical to fast and efficient electron transfer(ET)between ET proteins. The molecular mechanism of the affinity regulation, however, remains elusive due to the lack of crystal structures of the ET proteins in every redox state relevant to the ET reaction. BphA4 and BphA3 are, respectively, an FAD-containing NADH-dependent ferredoxin reductase and a Rieske-type[2Fe-2S]ferredoxin of a biphenyl dioxygenase BphA derived from Acidovorax sp. strain KKS102. Our biochemical study showed that the reduction of the FAD in BphA4 increases the affinity between BphA3 and BphA4 approximately 20-fold. In order to reveal the molecular mechanism of this redox-dependent affinity regulation, we determined the crystal structure of the following molecular species: BphA4 in oxidized, hydroquinone, semiquinone, and reoxidized forms; BphA3 in oxidized and reduced forms; and the ET complex of BphA3 and BphA4. A comparative analysis of these seven crystal structures obtained revealed that a series of conformational changes of BphA4 occurs upon reduction of FAD to form a high-affinity BphA3-binding site in BphA4.
  3. 電子伝達タンパク質間の酸化還元状態依存的親和性調節機構 千田美紀、木村成伸、福田雅夫、石田哲夫、千田俊哉 化学と生物 2008/10

論文

  1. 研究論文(学術雑誌) 共著 Complete pyridine nucleotide-specificity conversion of an NADH-dependent ferredoxin reductase. Akito Nishizawa, Ayaka Harada, Miki Senda, Yuka Tachihara, Daisuke Muramatsu, Shinya Kishigami, Shigemasa Mori, Keisuke Sugiyama, Toshiya Senda, shigenobu Kimura Biochem. J. 462/ 2, 257-265 2014/09/01 10.1042/BJ20140384 The coenzyme specificity of enzymes is one of the critical parameters for the engineered production of biological compounds using bacteria. Since NADPH is produced abundantly in photosynthetic organisms, conversion of an NADH-specific enzyme to an NADPH-specific one is a useful approach to the efficient carbon neutral production of biological compounds in photosynthetic organisms. In this study, an NADH-specific ferredoxin reductase component, BphA4 of biphenyl dioxygenase BphA from Acidovorax sp. strain KKS102, was changed to an NADPH-dependent form using a method combining structure-based systematic mutations and site-directed random mutagenesis. The resultant CRG mutant, in which Glu175-Thr176-Gln177 of an NADH recognition loop in the wild-type BphA4 was replaced with Cys175-Arg176-Gly177, was highly specific and active for NADPH, and its biochemical and structural properties for NADPH were nearly the same as those of the wild-type BphA4 for NADH. In addition, this mutation project was assessed by a semi-empirical prediction method of mutation effects, and the results suggested that the CRG mutant was one of the best NADPH-specific mutants.
  2. 研究論文(学術雑誌) 共著 Ribosome-binding site interference caused by Shine-Dalgarno-like nucleotide sequences in Escherichia coli cells Akito Nishizawa, Miki Nakayama, Takuya Uemura, Yoshiyuki Fukuda, and Shigenobu Kimura J. Biochem. 147/ 3, 433-443 2010/03 10.1093/jb/mvp187 Two-cistronic expression plasmids are useful for high-level expression of heterologous genes in Escherichia coli cells by preventing the inhibition of translational initiation. In the process of constructing a two-cistronic expression plasmid pCbSTCR-4 containing the fragments of the porcine cytochrome b5 (Psb5) and NADPH-cytochrome P450 reductase (PsCPR) genes as the first and second cistrons, respectively, the presence of a specific region in the first cistron that lowered the accumulation level of the PsCPR was suggested (Kimura, S. et al. (2005) J. Biochem. 137, 523–533). In this study, a disturbing nucleotide sequence similar to a Shine-Dalgarno (SD) sequence (SD-like sequence), AGGAG, was identified at the 5'-upstream region near the SD-sequence for the second cistron. Silent mutations in the SD-like sequence that lowered the similarity to a typical SD-sequence, increased the accumulation level of PsCPR. SD-like sequences introduced into mono-cistronic expression plasmids for the Psb5 and PsCPR genes also decreased the accumulation level of these proteins. The SD-like sequence also decreased the accumulation level of the insoluble PsCPR protein. This type of ribosome-binding site interference is useful not only for precise control of protein accumulation, but also for increasing the soluble form of recombinant proteins in E. coli cells.
  3. (MISC)総説・解説(学術雑誌) 共著 Redox control of protein conformation in flavoproteins. Toshiya Senda, Miki Senda, Shigenobu Kimura, Tetsuo Ishida Antioxidants & Redox Signaling 11/ 7, 1741-1766 2009 10.1089 Flavin adenine dinucleotide (FAD) and flavin mononucleotide (FMN) are two flavin prosthetic groups utilized as the redox centers of various proteins. The conformations and chemical properties of these flavins can be affected by their redox states as well as by photoreactions. Thus, proteins containing flavin (flavoproteins) can function not only as redox enzymes, but also as signaling molecules by using the redox- and/or light-dependent changes of the flavin. Redox and light-dependent conformational changes of flavoproteins are critical to many biological signaling systems. In this review, we summarize the molecular mechanisms of the redox-dependent conformational changes of flavoproteins and discuss their relationship to signaling functions. The redox-dependent (or light-excited) changes of flavin and neighboring residues in proteins act as molecular gswitchesh that gturn onh various conformational changes in proteins, and can be classified into five types. On the basis of the present analysis, we recommend future directions in molecular structural research on flavoenzymes and related proteins.
  4. 研究論文(学術雑誌) 共著 Molecular mechanism of the redox-dependent interaction between NADH-dependent ferredoxin reductase and Rieske-type [2Fe-2S] ferredoxin. Miki Senda, Shinya Kishigami, Shigenobu Kimura, Masao Fukuda, Tetsuo Ishida, Toshiya Senda J.Mol.Biol. 373/ 2, 382-400 2007/10/19 10.1016/j.jmb.2007.08.002 The electron transfer system of the biphenyl dioxygenase BphA, which is derived from Acidovorax sp. (formally Pseudomonas sp.) strain KKS102, is composed of a FAD-containing NADH-ferredoxin reductase (BphA4) and a Rieske-type [2Fe-2S] ferredoxin (BphA3). Biochemical studies have suggested that the whole electron transfer process from NADH to BphA3 comprises three consecutive elementary electron-transfer reactions, in which BphA3 and BphA4 interact transiently in a redox-dependent manner. Initially, BphA4 receives two electrons from NADH. The reduced BphA4 then delivers one electron each to the [2Fe-2S] cluster of the two BphA3 molecules through redox-dependent transient interactions. The reduced BphA3 transports the electron to BphA1A2, a terminal oxygenase, to support the activation of dioxygen for biphenyl dihydroxylation. In order to elucidate the molecular mechanisms of the sequential reaction and the redox-dependent interaction between BphA3 and BphA4, we determined the crystal structures of the productive BphA3-BphA4 complex, and of free BphA3 and BphA4 in all the redox states occurring in the catalytic cycle. The crystal structures of these reaction intermediates demonstrated that each elementary electron transfer induces a series of redox-dependent conformational changes in BphA3 and BphA4, which regulate the interaction between them. In addition, the conformational changes induced by the preceding electron transfer seem to induce the next electron transfer. The interplay of electron transfer and induced conformational changes seems to be critical to the sequential electron-transfer reaction from NADH to BphA3.
  5. 研究論文(学術雑誌) 共著 Two-citronic expression plasmids for high-level gene expression in Escherichia coli preventing translational initiation inhibition caused by the intramolecular local secondary structure of mRNA. Shigenobu Kimura, Tomoka Umemura, Takashi Iyanagi J. Biochem. 137/ 4, 523-533 2005 大腸菌での異種蛋白質遺伝子発現において、mRNAのリボソーム結合部位の分子内二次構造による翻訳阻害阻害を回避する目的で、2-シストロン性の高発現プラスミドpCP1及びpCP2を作製し、ブタ肝臓P450還元酵素遺伝子等を用いて、その有用性を確認した。

研究発表

  1. ポスター発表 Synechocystis sp. PCC6803由来ジフラビン結合ジスルフィド酸化還元酵素によるBphA3の還元 第91回日本生化学会大会 2018/09/26
  2. ポスター発表 大腸菌OmpA, PelBシグナル配列を用いたシアノバクテリアチラコイド膜画分への遺伝子組換え型タンパクの蓄積 第18回日本蛋白質科学会年会 2018/06/27
  3. ポスター発表 酸化型NADHシトクロムb5還元酵素の中性子構造解析 第18回日本蛋白質科学会年会 2018/06/27
  4. シンポジウム・ワークショップ パネル(指名) 酸化型NADHシトクロムb5還元酵素の中性子構造解析 第18回日本蛋白質科学会年会 2018/06/27
  5. ポスター発表 NADPH特異的bphA遺伝子群導入シアノバクテリア株のビフェニル水酸化活性 2017年度生命科学系学会合同年次大会(ConBio2017) 2017/12/07

知的財産権

  1. 特許 芳香族化合物分解能を有する光合成生物および芳香族化合物の分解方法 特願2010-13334 2010/01/25 特開2011-10651 2011/01/20 特許第5751756号 2015/05/29
  2. 特許 芳香族化合物分解能を有する光合成生物および芳香族化合物の分解方法 特願2009-133311 2009/06/02 特開2011-10651 2011/01/20 特許第5751756号 2015/05/29

受賞

  1. 平成23年度科研費審査委員表彰 科研費の第1段審査(書面審査)の検証結果に基づき、模範となる審査意見を付した審査委員。 2011/09/30 H23年度は約5,000名の第1段審査(書面審査)委員の中から49名が選考された。
  2. 日本生化学会 JB論文賞 2004年(第12回) 2004

担当授業科目

  1. 生化学
  2. 生命電子情報実験 I
  3. 応用機能化学実験 I
  4. 生命電子情報ゼミナール
  5. 機能化学ゼミナール

所属学協会

  1. 日本生化学会
  2. 日本蛋白質科学会
  3. 日本分子生物学会
  4. American Society of Biochemistry and Molecular Biology (ASBMB)

委員歴

  1. 日本生化学会 評議員 2014/10/01-現在
  2. 日本生化学会 代議員 2012/10/01-2013/09/30

学外教育

  1. 自治体での社会教育 平成30年度 ひたちなか市民大学 分子レベルでみる生命科学〜生命や生活に関わる分子のはなし〜 第1回 アミノ酸とタンパク質 第2回 遺伝子組換え技術とタンパク質工学 2018
  2. 出前授業 茨城県立牛久栄進高等学校 栄進プレ・カレッジ講座・「タンパク質分子をつくりかえる」 2017
  3. 自治体での社会教育 平成28年度未来の科学者育成プロジェクト事業「高校生科学体験教室」大腸菌を用いた遺伝子組換え型タンパク質の合成 2016
  4. その他 福島県立磐城高等学校 平成28年度「SSH総合の時間」茨城大学訪問研修 模擬授業「タンパク質分子をつくりかえる」 2016
  5. 自治体での社会教育 平成26年度未来の科学者育成プロジェクト事業「高校生科学体験教室」大腸菌を用いた遺伝子組換え型タンパク質の合成 2014

報道出演・資料(DB等)提供

  1. Go!Go!工学ガール vol. 14 化学で拓くバイオの世界 「生体分子機能工学科」 テレビ 2013/01/16
  2. 茨城新聞 新聞 2006/06/27
  3. NHK地方版ニュース テレビ 2006/06/26